Analizy cytotoksyczności

Badania cytotoksyczności cząsteczek potencjalnych leków na hodowle komórkowe in vitro stanowią doskonały wstęp ogólnie pojmowanych badań toksykologicznych, niezbędnych do określenia prawidłowego działania oraz bezpieczeństwa leku. W przypadku hodowli komórkowych badane substancje i ich prekursory lub metabolity dodawane są do medium
w celu określenia ich działania na poziomie komórkowym, a często także molekularnym. Zastosowanie modeli komórkowych w badaniach toksykologicznych posiada ponadto wiele zalet, takich jak: szybkość i łatwość badania procesów komórkowych i molekularnych, powtarzalność, możliwość stosowania niewielkich ilości badanych substancji, czy możliwość pracy na komórkach ludzkich.

BioCentrum oferuje szeroki zakres badań cytotoksyczności w hodowlach komórkowych in vitro wykonywanych w standardach DPL (dobrej praktyki laboratoryjnej) oraz przy użyciu odpowiednich modeli komórkowych. Badania prowadzone w laboratorium komórkowym naszej firmy wykonywane są w zależności od potrzeb na hodowlach komórkowych pierwotnych, a także różnorakich liniach komórkowych zarówno ustalonych, jak i ciągłych (nieśmiertelnych, pochodzenia nowotworowego).

Test MTT oraz MTS
Oba testy oparte są na zdolności enzymu dehydrogenazy mitochondrialnej do przekształcania pomarańczowej, rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolowej (MTT lub MTS) do formazanu będącego kolorowym produktem powyższej reakcji. W przypadku testu MTT produkt jest nierozpuszczalny w wodzie i wymaga rozpuszczenia w rozpuszczalnikach organicznych. Test MTS stanowi z kolei udoskonaloną wersję testu MTT, w której produkt reakcji konwersji soli tetrazolowej przez dehydrogenazę powstający w obecności PMS  (ang. phenazine methosulfate) jest w pełni rozpuszczalny w wodzie. Zdolność do produkcji formazanu mają tylko żywe komórki, co pozawala na szybkie i dokładne określenie procentu funkcjonalnych komórek oraz wpływu badanego czynnika na żywotność dowolnej linii komórkowej. Testy wykonywane są poprzez dodanie niewielkiej ilości reagentu bezpośrednio do hodowli komórkowych, inkubacji 1-4 godzin i pomiarze absorbancji za pomocą profesjonalnego wielofunkcyjnego czytnika płytek.

Test LDH
Test LDH podobnie do testów MTT oraz MTS jest testem kolorymetrycznym, polegającym na pomiarze absorbancji na skutek powstawania barwnego produktu reakcji enzymatycznej. Polega on na pomiarze ilości dehydrogenazy mleczanowej (ang. lactate dehydrogenase, LDH), wewnątrzkomórkowego enzymu cytoplazmatycznego, uwalnianego z komórki do medium hodowlanego na skutek jej lizy. Badanie polega na określeniu ilości LDH uwolnionej z martwych komórek poprzez pomiar reakcji enzymatycznej konwersji soli tetrazolowej do barwnego formazanu w nadsączach znad komórek inkubowanych z badanym czynnikiem.

Test BrdU
Test powyższy jest kolejnym standardowym testem używanym w badaniach toksykologicznych in vitro. Polega on na ilościowym pomiarze syntezy DNA, a więc proliferacji komórek. Bromodeoksyurydyna (ang. bromodeoxyuridine, BrdU) jest syntetycznym analogiem nukleozydu tymidyny inkorporowanym do DNA w dzielącej się komórce w trakcie fazy S podziału komórki. Detekcja BrdU za pomocą specyficznego przeciwciała sprzężonego z enzymem oraz reakcja enzymatyczna powyższego enzymu
z chromogennym substratem pozwala na kolorymetryczną analizę zdolności proliferacyjnych komórek. Pozytywny wynik BrdU świadczy o żywotności i funkcjonalności danej linii komórkowej. Obecnie test BrdU stosowany jest w badaniach takich jak: oznaczanie proliferacji komórek indukowanej czynnikami wzrostowymi, innymi cytokinami, a także badanymi cząsteczkami chemicznymi, analiza immunoreaktywności limfocytów pod wpływem stymulacji miogenami i antygenami, czy wrażliwości komórek nowotworowych na leki cytostatyczne.