Sekwencjonowanie białek


W BioCentrum oznaczamy sekwencje białek i peptydów - zarówno poprzez sekwencjonowanie metodą chemiczną (degradacja Edmana), jak również metodą spektrometrii masowej (mapy peptydowe). Proponowana metoda chemiczna pozwala na precyzyjną analizę de novo sekwencji próbki białkowej i rekomendowana jest głównie do pojedynczych analiz białek o mniejszej masie cząsteczkowej (do 500 aa). W przypadku wielu próbek oraz białek o masie powyżej 500 aa rekomendowana jest analiza sekwencji metodą spektrometrii masowej.

Sekwencjonowanie metodą degradacji Edmana
BioCentrum oferuje sekwencjonowanie białek i peptydów za pomocą automatycznego sekwenatora Procise 491 (Applied Biosystems), który realizuje chemiczną degradację Edmana łańcuchów polipeptydowych. Metoda ta polega na sekwencyjnym odszczepianiu reszt aminokwasowych od N-końca białka przy wykorzystaniu fenyloizotiocjanianu (PITC). Następnie powstające  fenylotiokarbamidowe pochodne aminokwasów analizowane są przy zastosowaniu chromatografii HPLC. Z otrzymanych 50 pikomoli homogennej próbki można uzyskać sekwencję około 10-20 reszt aminokwasowych. Z 200 pikomoli maksymalnie 20-30 reszt, natomiast przy ilościach rzędu jednego nanomola można otrzymać maksymalnie 40-50 reszt i jest to górny pułap możliwości aparatu. Długość sekwencjonowania zmniejsza się w przypadku białek bogatych w prolinę i modyfikowanych (np. glikozylowanych lub zawierających bloki poli-histydynowe).

Białka i peptydy sekwencjonowane są głównie z cieczy, niemniej jednak w przypadku nie-homogennych preparatów możliwa jest analiza białek/peptydów z błony PVDF, po wcześniejszym rozdziale elektroforetycznym. Automatyczny sekwenator pozwala na identyfikację 19 standardowych aminokwasów (Asn, Asp, Gln, Glu, Ser, Gly, His, Arg, Thr, Ala, Pro, Tyr, Val, Met, Ile, Leu, Phe, Lys, Trp). Reszty Cys mogą być zidentyfikowane jedynie po przeprowadzeniu je w trwałe pochodne z wykorzystaniem np. bromopropyloaminy, winylopirydyny lub akrylamidu . Procedurę konwersji cystein przeprowadzamy na zamówienie, po wcześniejszych uzgodnieniach. W przypadku próbek dłuższych niż 40 aa, oferujemy fragmentacje białka, a następnie sekwencjonowanie powstałych produktów. Analizy sekwencji wykonujemy w ścisłym kontakcie elektronicznym z klientem, możliwa jest więc bieżąca analiza wyników oraz dostosowywanie parametrów analiz do oczekiwań klienta.

Sekwencjonowanie białek – MS
Z wykorzystaniem technik spektrometrii mas BioCentrum wykonuje mapy peptydowe służące do identyfikacji nieznanego białka. Uzyskiwane wyniki poddawane są analizie bioinformatycznej z wykorzystaniem baz danych Mascot.

Wszelkie pytania dotyczące metodyki nalezy kierować do: Ten adres email jest ukrywany przed spamerami, włącz obsługę JavaScript w przeglądarce, by go zobaczyć